① 引物：如果引物设计不优，如引物设计软件得出的引物评分较低、引物扩增效率不满足90-110%，主要原因可能是引物本身质量不佳导致体系出现非特异性扩增。

解决方案：

重新设计引物，选择引物设计软件评分较高的2-3对引物进行合成，之后选择融解曲线无杂峰，扩增效率满足90-110%，且更接近100%的引物作为该基因的引物。

若该杂峰为引物二聚体引起，适当降低引物的投入量可以有效抑制引物二聚体的产生。

② 模板：cDNA模板存在基因组污染。

解决方案：

设计跨内含子引物进而避免基因组污染带来的干扰；或者选用带有基因组清除的逆转录试剂盒，逆转录前对RNA中混有的基因组进行清除。

③ C_T值偏大：C_T值≥30，可能是由于基因本身表达量低、或者扩增效率不满足90-110%而导致的基因C_T值偏大。C_T值较大的情况下，融解曲线容易出现杂峰。